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Hematoxilina-Eosina e outras colorações histológicas e microbianas

1 ano atrás
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por Joyce Fernandes
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Escrito por Joyce Fernandes
4.7
(27)

Desde o 1º período da faculdade de Medicina, você se depara com o laboratório de microscopia, seja na disciplina de histologia, onde todos os tecidos do nosso organismo podem ser observados no microscópio, sendo possível observar as células e como o tecido é estruturado, ou na disciplina de microbiologia, na qual estudamos diversos microrganismos e os observamos como bactérias, por exemplo. Mais a frente, você entra na patologia e novamente observa essas imagens histológicas microscópicas, com alterações patológicas, porém a coloração se faz da mesma forma. Mas para que tudo isso seja possível, as lâminas para observação precisam ser preparadas, passando por várias etapas, e uma dessas etapas é a coloração. Ou seja, esses tecidos e microrganismos são corados para que consigamos vê-los na microscopia óptica.

As colorações nem sempre são as mesmas, pois temos colorações que facilitam a observação de determinado tecido ou determinado microrganismo.

Figura 1: Observação de lâmina em um microscópio óptico

Hematoxilina – Eosina, H&E ou HE

Uma dessas colorações, muito conhecida por sinal, é a coloração de hematoxilina-eosina (HE), você já deve ter ouvido falar. Essa coloração é muito utilizada na histologia para corar diversos tecidos do nosso organismo. Provavelmente foi a primeira coloração que você viu. “Mas como é realizada, e por que recebe tal nome?”. Isso é de grande importância para entender o que significa cada cor presente na lâmina. A hematoxilina é um corante básico, que tem atração a substâncias ácidas (lembra que os opostos se atraem). Essas substâncias ácidas, portanto, são coradas pela hematoxilina, e recebem o nome de basófilas (que fixam corantes básicos, pois “gostam” de básicos). Mas nem tudo é ácido nas células e tecidos. A eosina, ao contrário da hematoxilina, tem caráter ácido, e sendo assim atrai substâncias básicas, conhecidas como acidófilas (que fixam corantes ácidos).

“Já entendi quem cora as substâncias ácidas e as básicas, mas e aí? Como eu vou saber isso apenas olhando uma lâmina?”. É simples, a hematoxilina é um corante de cor azul-púrpura, ou seja, o que você observar na lâmina que tenha essa cor, você já sabe que é uma substância de caráter ácido, sendo, portanto basófila, pois foi atraída pela hematoxilina. E a eosina é um corante vermelho. Sendo assim, tudo aquilo que você observar na lâmina que seja dessa cor, é uma substância básica, e que foi atraída pela eosina que é ácida, sendo então uma substância acidófila.

Resumindo:

Corante Substância corada Característica por Afinidade Coloração
Hematoxilina (básica) Ácida Basófila Azul-púrpura
Eosina (ácida) Básica Acidófila Vermelho

Exemplificando:

Quando observamos por microscopia uma célula, seu núcleo se apresenta na coloração azul-púrpura, ou seja, é basófilo. Isso porque o núcleo de uma célula é rico em DNA (Ácido desoxirribonucleico), ou seja, é ácido, e, portanto, é atraído pele hematoxilina (um corante básico).

Já o citoplasma da célula possui um caráter mais básico e é, portanto, corado em tonalidades de vermelho pela eosina. Algumas regiões do citoplasma podem se apresentar azuladas, pois, em algumas regiões há RNA (Ácido ribonucleico), que é corado pela hematoxilina.

Figura 2: Imagem histológica da glândula tireoide, corada por hematoxilina – eosina. Em roxo vemos os núcleos das células foliculares. Em rosa vemos o citoplasma dessas células, vemos também o colóide (local de armazenamento dos hormônios tireoidianos).

Essa coloração é a mais utilizada em histologia e patologia, mas não é a única, pois nem todas as estruturas podem ser observadas pela HE.

Coloração em prata

Alguns tecidos não são corados pela Hematoxilina – Eosina, como é o caso de fibras reticulares.

As fibras reticulares são formadas por colágeno do tipo III, e ricas em glicoproteínas e proteoglicanos, que formam as redes. Estão presentes em órgãos como fígado, medula óssea, baço, linfonodos, entre outros, e formam um arcabouço, uma rede de sustentação. E é assim que elas são vistas no microscópio.

Para observar essas fibras em microscopia óptica, algumas técnicas específicas podem ser utilizadas, como a coloração ou impregnação em prata.

Essas fibras possuem a peculiaridade da argirofilia. Calma, já vou dizer o que significa isso. Argirofilia é uma palavra que deriva do grego, e quer dizer àrgyros (= prata) e philia (= amor, amigo), ou seja, substâncias que são identificadas pela prata por terem afinidade pela mesma.

Ao observar a lâmina impregnada pela prata, essas fibras apresentam-se enegrecidas.

Figura 3: Histologia hepática. Impregnação em prata onde vemos as fibras reticulares enegrecidas.

Tricômico de Masson

Como o nome sugere, tricômico, utiliza-se três cores, que irão diferenciar diferentes estruturas. Mas o principal destaque dessa técnica são as fibras de colágeno do tipo I, facilitando a sua observação. Nessa técnica, as fibras colágenas assumem a coloração verde.

Além disso, permitem observar o núcleo e o citoplasma das células muito bem.

Coloração Gram

Na microbiologia, você já deve ter ouvido sobre a coloração de GRAM, utilizada para corar lâminas com determinadas bactérias. Uma técnica antiga, e amplamente utilizada até os dias atuais.

Se justifica pela composição da parede bacteriana. É isso mesmo, a composição da parede das bactérias define a coloração em Gram, e são separadas então em dois grandes grupos bacterianos: GRAM + (positivas) e GRAM – (negativas). “Mas por que fazer uma coloração se elas já são diferentes pela parede?” Apesar da parede ter diferenças importantes na composição e na espessura, não conseguimos observar esses detalhes na microscopia óptica, e foi por isso que Gram desenvolveu a técnica que cora esses dois grupos bacterianos, de colorações diferentes, de acordo com sua parede, assim podemos diferenciá-las pela cor apresentada na lâmina.

Uma bactéria conhecida como GRAM + (positiva) é uma bactéria que possui várias camadas de peptideoglicano, formando uma parede espessa, mas não possuem membrana externa.

Já as bactérias conhecidas por serem GRAM – (negativas), possuem uma fina camada de peptideoglicano, mas possuem membrana externa (composta principalmente por LPS – Lipopolissacarídeo).

Até agora falei da composição da parede, mas como já disse, isso não é visto pelo microscópio óptico. Vamos falar então, daquilo que dá pra ver, que é a cor.

A técnica é realizada utilizando:

  1. Primeiro, coloca-se o material a ser avaliado na lâmina.
  2. Cristal Violeta (violeta de genciana): aplica o cristal, que leva a uma coloração bem roxa.
  3. Lava-se com água
  4. Lugol (um mordente para fixar o corante violeta)
  5. Lava com água
  6. Descoloração com álcool
  7. Fucsina (corante avermelhado)
  8. Lava a lâmina com água
  9. Seca a lâmina, e então observa no microscópio

Agora vamos entender o que acontece nessas etapas.

As bactérias GRAM positivas são bactérias com parede espessa. Ao colocar o corante violeta, a sua parede absorve muito essa violeta, assumindo a coloração roxa. Quando chega na etapa de descoloração com álcool, elas não são descoradas, pois sua parede possui várias camadas e a violeta de genciana se fixou fortemente ali. E ao adicionar a fucsina, essa parede também não absorve a fucsina, pois já possui seu corante de violeta. Por isso, as bactérias GRAM positivas possuem coloração roxa.

Exemplos de Gêneros de Bactérias GRAM positivas: Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus

Figura 4: Bactérias coradas pelo método Gram. São bactérias gram positivas, apresentando portanto coloração roxa. Na lâmina vemos Staphylococcus aureus, cocos gram positivos, dispostos em cachos de uva.

Já as bactérias GRAM negativas, por sua vez, são bactérias com parede delgada. Quando adiciona a violeta, elas se coram, porém, ao lavar, essa violeta começa a ser removida. E, na descoloração com álcool, a remoção do corante violeta se conclui, pois, a parede é muito fina, e quase não absorveu o corante. Com isso, essas bactérias tornam-se novamente descoradas, o que impossibilitaria visualizá-las no microscópio. Então, adiciona-se a fucsina, e como essas bactérias estão descoradas, elas absorvem a fucsina, e passam a apresentar a coloração avermelhada.

Exemplos de Bactérias GRAM negativas: Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella, Shigella.

Figura 5: Coloração de GRAM – bactéria gram negativa, dispostas em bastonetes vermelhos.

E assim, você consegue identificar a qual grupo essa bactéria pertence, de acordo com sua coloração.

Bactéria Parede Cor
GRAM positiva Espessa Roxa
GRAM negativa Delgada Vermelha

Mas nem todas as bactérias são bem coradas pelo método de GRAM, e portanto, existem outros métodos, como veremos a seguir.

Coloração de Ziehl – Neelsen (ZN)

Algumas bactérias não são bem coradas pelo método de GRAM, e portanto outros métodos são utilizados, como a técnica de Ziehl – Neelsen. Algumas importantes bactérias, são coradas por essa técnica como as bactérias do gênero Mycobacterium, da tuberculose e da lepra, por exemplo.

Essas bactérias são álcool – ácido resistentes (BAAR), e sendo assim, resistente àquela etapa de descoloração do método de GRAM. Essa característica se deve também a composição da parede dessas micobactérias, que possuem ácidos micólicos (lipídeos).

A técnica é realizada da seguinte maneira:

  1. Aplicação do material a ser analisado, por exemplo uma amostra de escarro.
  2. Adicionar fucsina na lâmina
  3. Aquecer a lâmina até a emissão de vapores (não deixando ferver)
  4. Aguardar cerca de 7 minutos
  5. Lavar com água
  6. Cobrir a lâmina com álcool – ácido até descorar o esfregaço
  7. Lavar com água
  8. Cobrir a lâmina com azul de metileno
  9. Lavar com água
  10. Secar e observar ao microscópio

E qual o sentido de tudo isso? É simples. Ao aquecer a lâmina contendo a fucsina, os lipídeos são derretidos pela ação do calor. Com isso, a fucsina penetra em todas as bactérias. Ao descorar com álcool – ácido, todas as bactérias são descoradas, exceto as bactérias álcool – ácido resistentes. Ou seja, essas bactérias estarão na cor vermelha, pois foram coradas com a fucsina. Já as demais bactérias, que foram decoradas, estão sem coloração nenhuma. Então, quando adiciona o azul de metileno, elas assumem tal coloração.

Resumindo:

Parede Bacteriana Cor
Álcool – ácido resistente (BAAR) Vermelha
Álcool – ácido não resistente Azul
Figura 6: Mycobacterium tuberculosis – Corado em vermelho pela Técnica de Ziehl – Neelsen.

Coloração de Giemsa

Uma outra coloração muito utilizada, e que não eu não poderia deixar de falar, é a coloração de Giemsa. Muito utilizada para corar lâminas de sangue periférico ou da medula óssea.

Por meio dessa coloração, podemos observar as células sanguíneas (plaquetas, eritrócitos e leucócitos). Também utilizada para visualizar protozoários do gênero Plasmodium (o causador da malária).

Quando observamos uma lâmina de sangue periférico, corada por Giemsa, temos as células sanguíneas em diferentes aspectos e colorações, podendo, então, diferenciá-las.

As plaquetas apresentam-se numa coloração próxima do azul.

Figura 7: As plaquetas são as menores células observadas na lâmina.

Já as hemácias/eritrócitossão visualizados na cor rósea (com palidez central – o centro se apresenta mais claro).

Figura 8: As hemácias são visualizadas, sendo o componente celular mais presente no sangue, como observa-se na lâmina. Possuem essa coloração rósea, e o centro claro, devido a hemoglobina.

Os leucócitos, que são muitos, podem ser diferenciados em microscopia óptica, quando corados por Giemsa.

Os linfócitos apresentam o citoplasma azul e o núcleo azul-violeta (mais escuro).

Figura 9: Lâmina de sangue corada por Giemsa, observa-se ao centro uma célula, com amplo núcleo na coloração azul, e escasso citoplasma azulado.

Já os monócitos possuem uma peculiaridade em seu núcleo, que é o aspecto lobulado, e este apresenta-se na coloração azul violeta, enquanto o citoplasma é azul claro.

Os granulócitos, como o próprio nome diz, contém grânulos, que são vistos no citoplasma. Os granulócitos são neutrófilos, basófilos e eosinófilos. Os neutrófilos são polimorfonucleares, tendo entre 2 e 4 lóbulos, e seu núcleo é corado em azul. Seu citoplasma apresenta cor rosa pálido, e contém também grânulos, que são vistos numa coloração de tons róseos a azul claro.

Figura 10: Lâmina de sangue corada por Giemsa, observa-se em grande quantidade as hemácias, e um neutrófilo que apresenta núcleo com vários lóbulos, corado em azul, e o citoplasma corado em rosa pálido.

Já os basófilos possuem o núcleo azul escuro, mas sua grande peculiaridade são seus grânulos, que são volumosos, corados também em azul escuro, ocupando todo o citoplasma, e podendo se sobrepor ao núcleo também.

Figura 11: Lâmina de sangue corada por Giemsa, onde observamos a presença do basófilo.

E os eosinófilospossuem o núcleo azul, citoplasma rosa pálido, e seus grânulos são vermelhos, ao contrário dos outros granulócitos.

E além de corar as células sanguíneas, permitindo-nos observar todas essas características morfológicas, a técnica de Giemsa também cora alguns parasitas, como é o caso do Plasmodium (causador da Malária) e do Trypanosoma cruzi (agente causador da doença de Chagas), sendo então de suma importância para o diagnóstico de tais doenças.

Figura 12: Lâmina corada por Giemsa, possibilitando a observação do protozoário Trypanosoma cruzi, o causador da Doença de Chagas (Tripanossomíase Americana).

Todas essas técnicas mostradas nesse artigo são técnicas muito utilizadas para estudo de diversas estruturas, sejam essas estruturas os tecidos que compõe o organismo, ou microrganismos. Mas não são as únicas colorações. Há uma infinidade de colorações diferentes, e específicas, que você pode se deparar ao longo do caminho, dependendo de qual seja a área estudada. Mas tenho certeza que essas colorações abordadas hoje são muito recorrentes e importantes. Sendo assim, é bom que você saiba identificá-las e entendê-las, pois, dessa forma, certamente seu estudo se tornará mais fácil e mais eficaz.

Bons estudos!!

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